生物學(xué)實驗室檢測安裝驗證

生物制品質(zhì)量控制中采用的方法包括理化分析方法和生物學(xué)測定方法，其中理化分析方法的驗證原則與化學(xué)制品基本相同，具體驗證時還需結(jié)合生物制品的特點考慮。生物學(xué)測定系指采用生物學(xué)方法，以反映被測物的生物學(xué)特性為目的的測定方法。

（1）生物學(xué)測定常用方法

生物學(xué)測定方法可廣泛用于各種檢測目的，包括鑒別、生物活性和雜質(zhì)檢測等，其中最主要的是生物活性（或效價、效力）測定，生物制品質(zhì)量控制中經(jīng)常采用的方法如下。

①以整體動物為試驗材料檢測制品生物活性（或效力）的動物試驗，一般用于成品檢定。如動物保護(hù)力試驗，用于疫苗的效力測定。

②在細(xì)胞水平上測定產(chǎn)品的生物活性的細(xì)胞測定試驗。常用于各種生物制品的活性(效力)測定。這類方法的變異較大。

③利用酶反應(yīng)速率或免疫相互作用誘導(dǎo)的生物反應(yīng)等方法測定生物活性的生化檢測方法。這類方法的變異相對較小,結(jié)果比較準(zhǔn)確。

（2）生物學(xué)檢測方法驗證的范圍

一般情況下，需驗證的分析項目有:鑒別試驗、純度和雜質(zhì)檢查、原液或制劑中有效成分的含量測定及生物活性測定。其他質(zhì)控方法，如必要時也應(yīng)加以驗證。

（3）生物學(xué)檢測方法驗證文件的建立

生物學(xué)測定方法驗證方案中應(yīng)包括驗證用樣品的類型和數(shù)量、試驗設(shè)計（包括組內(nèi)組間因素)、驗證參數(shù)和參數(shù)的可接受標(biāo)準(zhǔn)以及數(shù)據(jù)分析規(guī)范等內(nèi)容。

驗證用樣品從日常檢測該項目的樣品中隨機選擇，并確保能代表整體物料的特性。樣品制備應(yīng)在驗證序列中單獨進(jìn)行。

生物測定方法中的某些操作因素（溫度、酸度、培養(yǎng)時間等）可能導(dǎo)致測量的組間變異，這些因素通常在研發(fā)階段通過實驗設(shè)計（動物數(shù)量、稀釋數(shù)量、每個稀釋度的平行測定、稀釋間距等）的可接受標(biāo)準(zhǔn)和數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析來進(jìn)行評估。試驗設(shè)計應(yīng)考慮測量流程的所有變異源因素，包括取樣、樣品制備、組內(nèi)和組間因素，使用交叉或嵌套的實驗設(shè)計來揭示變異的重要來源,保證長期條件下變異具有代表性。

關(guān)于驗證可接受標(biāo)準(zhǔn)的設(shè)定，如果目前存在質(zhì)量規(guī)范的產(chǎn)品，可接受標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)基于測量值可能落在產(chǎn)品規(guī)范范圍外的風(fēng)險進(jìn)行判斷和設(shè)定?？墒褂眠^程能力指數(shù)來獲悉偏差和中間精密度的邊界。中凈環(huán)球凈化可提供生物實驗室、微生物實驗室、細(xì)胞實驗室、凈化工程等的咨詢、規(guī)劃、設(shè)計、施工、安裝改造等配套服務(wù)。

生物學(xué)測定方法驗證結(jié)果應(yīng)記錄在驗證報告中。驗證報告應(yīng)支持方法適用于預(yù)期使用目的的結(jié)論或指明糾正行動。報告應(yīng)包括研究的原始數(shù)據(jù)和統(tǒng)計學(xué)運算。驗證數(shù)據(jù)的深入分析包括圖解和統(tǒng)計摘要,指出驗證參數(shù)和他們與目標(biāo)可接受標(biāo)準(zhǔn)的一致性。

（4）生物學(xué)檢測方法的驗證

生物學(xué)性質(zhì)測定方法驗證的主要指南包括:

FDA 工業(yè)指南  生物制品分析規(guī)程及方法驗證;

原CFDA CDE 生物制品質(zhì)量控制分析方法驗證技術(shù)審評一般原則。

①專屬性    生物學(xué)測定方法的專屬性與測定方法及產(chǎn)品組成密切相關(guān)所以應(yīng)從測試原理、測試用材料和供試品組成等方面分析方法的專屬性。

如采用免疫印跡試驗進(jìn)行生物制品的鑒別，應(yīng)首先對所使用抗體的特異性進(jìn)行分析;若供試品中還存在其他組分，則應(yīng)進(jìn)一步驗證被檢測物中其他物質(zhì)能否引起非特異性免疫反應(yīng)。

如采用細(xì)胞測定方法檢測生物活性，應(yīng)首先說明被測物質(zhì)與特定的細(xì)胞應(yīng)答之間的相關(guān)性。為表明細(xì)胞測定方法的特異性，可進(jìn)行相關(guān)試驗進(jìn)行驗證，如加入抗體或特異抑制劑的封閉實驗等。如果成品中加入了可能影響活性測定的輔料，應(yīng)進(jìn)行相關(guān)驗證以排除此種影響。

如采用 ELISA 法檢測重組產(chǎn)品的殘余宿主蛋白含量，可采用與表達(dá)體系相同的宿主細(xì)胞的蛋白作為免疫原制備抗體，若采用與產(chǎn)品相似工藝進(jìn)行處理后再免疫動物，則所獲得抗體的特異性更好。另外，產(chǎn)品中存在的大量目的蛋白可能影響宿主蛋白的測定，應(yīng)進(jìn)行相關(guān)驗證以排除此種影響。

②準(zhǔn)確度    生物制品的生物學(xué)活性為相對活性，一般與同時進(jìn)行測定的標(biāo)準(zhǔn)品/參考品進(jìn)行比較而得，所以應(yīng)對單位有一個適當(dāng)?shù)亩x或以適用的標(biāo)準(zhǔn)品/參考品作為對照經(jīng)計算而得。為得到準(zhǔn)確的測定結(jié)果,應(yīng)注意以下幾點。

a.必須同時測定供試品和標(biāo)準(zhǔn)品/參考品的劑量反應(yīng)曲線，而且兩條曲線必須具有平行性。

b.應(yīng)盡可能使供試品隨機分布及保證測試系統(tǒng)的平衡性。需對引起系統(tǒng)偏差的某些因素進(jìn)行分析排除，如不同的試驗平板、平板的不同位置（如邊緣效應(yīng))、檢測次序、動物實驗中的籠子效應(yīng)等。

以相對效價測定方法為例，準(zhǔn)確度驗證的范圍應(yīng)包括方法日常使用的范圍;可信賴的準(zhǔn)確度評估需要測定范圍內(nèi)至少3個效價水平，推薦5個效價水平的評估;最常用的方式是通過稀釋標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或已知效價的樣品獲取目標(biāo)標(biāo)效，這種類型的方法經(jīng)常被稱為稀釋線性試驗。

③精密度    由于各種生物活性測定方法的變異均較大，所以精密度往往不太理想。

重復(fù)性的驗證，建議在期望的濃度范圍內(nèi)至少選取三個濃度水平，每個濃度至少應(yīng)測定5次,求得每個濃度水平的精密度。

對于不同測定方法，其精密度可有較大不同，一般情況下，酶法:小于20%;結(jié)合試驗:小于20%;細(xì)胞試驗:小于30%:動物試驗:小于50%。對于一些尚不成熟的試驗方法或某些特殊方法（如珀斑試驗)，其方法變異可能會更大些。

④線性    線性關(guān)系一般是指檢測結(jié)果與樣品含量的直線相關(guān)性，而且一般情況下線性關(guān)系是定量測定的基礎(chǔ)，所以應(yīng)盡可能摸索出存在較好線性關(guān)系的測定方法并進(jìn)行線性驗證。

線性可以直接對標(biāo)準(zhǔn)品、供試品進(jìn)行測定。為了建立線性關(guān)系，建議至少要用5個濃度點，每一濃度測定3次，每次重復(fù)測定3份，用這些結(jié)果計算響應(yīng)值與被分析物的濃度的比例關(guān)系,或通過定義明確的數(shù)學(xué)計算形成比例關(guān)系。

某些生物活性測定方法線性范圍較?。ㄈ缂?xì)胞測定中呈S曲線)，采用曲線擬合的方法應(yīng)更合理。

應(yīng)提供相關(guān)系數(shù)、Y軸上的截距、回歸線的斜率等數(shù)據(jù)，還可以分析實測值與回歸線的偏差（離散性)，以助于對線性作出評價。

⑤范圍    具體的范圍一般根據(jù)檢測的目的而設(shè)定。驗證時所設(shè)定的范圍應(yīng)至少包括了產(chǎn)品規(guī)范中的范圍，如標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定成品生物活性應(yīng)為標(biāo)示量的80 %～120%，則驗證的范圍可設(shè)定為標(biāo)示量的70%～130%。

對于生物制品的生物活性測定而言，精密度、線性和范圍是非常重要的驗證參數(shù)。為減少驗證工作的繁雜性，可將范圍研究與精密度、線性研究合并進(jìn)行。

⑥耐用性    由于生物學(xué)測定結(jié)果對分析條件往往比較敏感，所以方法的耐用性驗證非常重要,根據(jù)具體情況,可針對關(guān)鍵的參數(shù)進(jìn)行耐用性驗證。

耐用性是通過有效地改變實驗方法的參數(shù)，來測定此改變對試驗結(jié)果的影響，即實驗結(jié)果不受影響的承受程度。在每種試驗條件下，對準(zhǔn)確性、精密性或其他參數(shù)進(jìn)行測定，以確定試驗方法的耐受或承受能力。在研制階段即應(yīng)進(jìn)行耐用性的評估，它應(yīng)能表明在方法的參數(shù)有微小改變時該分析方法仍然是可靠的。

⑦檢測限度和定量限度    對于已建立的雜質(zhì)檢測方法，應(yīng)進(jìn)行檢測限和定量限驗證。檢測限和定量限可以通過直觀法、信噪比法等測定。

（5）案例分析

下表為相對效價測定方法驗證案例,僅供參考。

相對效價測定方法驗證案例

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